Le labo de Sonia

pour mieux comprendre

vendredi 24 juillet 2009 par Sonia Sintès

L’électrophorèse est une technique utilisée pour séparer des molécules d’un mélange. C’est une méthode d’analyse et de fractionnement basé sur le déplacement de particules chargées dans un champ électrique formé par un courant électrique crée par un générateur en tension continue. Ces particules sont des protéines ou des acides aminés. Elles migrent en fonction de leurs charges. Dans l’électrophorèse de zone, le champ électrique est fourni par la différence de potentiel applique aux électrodes plongeant dans des bacs d’électrolytes (tampon), le courant électrique est enfermé.

I) Le déplacement de particules dépend de plusieurs facteurs :

•Le pH du tampon qui conditionne la charge de la particule :

o si le pHi est supérieur au pH, la charge globale de la particule est positive, les cations migrent vers le pole négatif la cathode.

o Si le pHi est inférieur au pH, la charge globale de la particule est négative, les anions vont vers le pole positif l’anode.

• Le champ électrique qui doit-être maintenu constant toute la durée de la migration

• Le temps minimum de migration, la migration s’arrete quand la charge des molécules est neutre, il est donc inutile de dépasser le temps de migration.

• Les forces de frottement lié a la taille de la molécule et à la viscosité du milieu.

• Les courants liquidiens :

o Les courants d’électro-endosmose qui résultent du déplacement d’un liquide en sens inverse du sens de la migration des macro-molécules.

o Les courants d’évaporation qui proviennent de l’échauffement de la bande suite au passage du courant. Cette évaporation plus importante au centre provoque une circulation de tampon des extrémités vers le milieu de la bande.

o Les courants d’électrolyse qui résultent de la migration rapide de petits ions du tampon qui se déplacent vers l’électrode de signe opposé à leur charge pour se décharger a leur contact.

II) L’électrophorèse peut-être verticale ou horizontale, elle peut-être réalisé :

• En milieu liquide, on l’appelle électrophorèse de tiselius, ou a veine liquide, ou a front mobile.

• Au sein d’un support poreux imprégné de tampon. La résolution y est nettement meilleur car le support limite la diffusion de la molécule séparée, celle-ci formes des bandes d’où l’appellation d’électrophorèse de zones.

III) Les supports sont constitués de macro-molécules glucidiques qui forment un reseau de mailles denses :

• Le papier est utilisé pour la séparation des petites molécules (acides aminés - petites protéines), les oses et les osides chargées.

• L’acétate de cellulose et l’amidon sont adaptés à la séparation des protéines et sont très employés en analyse biologique.

• Les gels d’agarose et de polyacrylamide sont préférables pour les séparations très fines de protéines et les acides nucléiques.

IV) La révélation des Electrophoregramme peut-être totale ou sélective :

• En révélation totale, on utilise par exemple :

o L’affinité des protéines pour les colorants (rouge ponceau, bleu de coomassie)

o L’affinité des acides nucléiques pour des agents qui s’intercalent entre les bases (bromure d’ethydium, BET (cancérigène)) et qui provoquent une émission de fluorescence en présence d’UV.

• La révélation sélective emploie des propriétés particulières de chaques molécules à visualiser :

o L’activité enzymatique permettant la libération locale d’un composé coloré.

o La spécificité antigénique dans les immunoélectrophorèses.

V) Matériel utilisé pour l’électrophorèse isoélectrofocalisation.

Générateur de courant pouvant fournir une tension de 160 V (20 mA). Cuve à électrophorèse avec son portoir et ses câbles d’alimentation.

Capillaire ou cônes de 5µL pour micropipette ou pipette boule. Bandes d’acétate de cellulose (support poreux ou gélifié) Attention conservation dans le Méthanol, donc utiliser une hotte pour les extraire de leur sachet. Tampon Véronal-Tris (pH 9,2) Colorant Rouge Ponceau Décolorant : solution d’acide acétique à5%

VI) Technique pour electrophorèse isoélectrofocalisation.

Exemple en pH 9,2 et le pHi < à 9,2

• 10 à 20 minutes avant le TP. Mettre à tremper les bandes d’acétate de cellulose dans le Tampon pH 9,2. Le faire sous hotte pour éviter les inhalations de Méthanol dans lequel les bandes sont conservées.

• Remplir les deux compartiments de la cuve avec le même volume de tampon pH 9,2. ne pas déborder pour ne pas faire communiquer les deux bacs.

• Calculer le pHi pour savoir où faire le dépôt ou se reporter à la notice d’emploi.

• Sortir les bandes du milieu tampon, en veillant à disposer la face absorbante vers le haut, tracer un trait de repère où seront déposés les échantillons pour connaitre l’endroit exact de départ de migration.

• Placer la bande sur le portoir. En générale de la façon suivante, mais se reporté à la notice d’emploi :

ou

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 La bande doit être tendue et ses extrémités doivent dépasser suffisamment pour tremper dans le tampon pH. Mettre en place les maintiens. Et le support dans la cuve.

 • Prélever l’échantillon avec un capillaire ou une micropipette et le déposer sur la bande déjà en place sur son support dans la cuve, dans un des repères prévus.

 • Changer d’applicateur pour éviter les contaminations entre les solutions différentes, et recommencer pour chaque échantillon.

 • Fermer la cuve, en respectant les polarités, la relier au générateur. Positionner l’interrupteur sur 160 V. Mettre sous tension et respecter le temps de migration indiqué sur la notice d’emploi.

 • Une fois la migration terminée, arrêter le générateur et déconnecter la cuve.

 • Placer la bande dans la solution de rouge Ponceau pendant 10 minutes en veillant a ce que la bande soit complètement émergée dans le colorant.

 • Décolorer 10 minutes dans chacun des 3 bains successifs d’acide acétique à 5%.

Electrophoregramme

 
 
 
 
 
 
 Un bain de transparence peut également être fait, il n’est cependant pas indispensable, et a base de méthanol, donc dangereux. Se référé à la notice d’emploi.


Forum

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